在 AAV（腺相关病毒）生产过程中，收获阶段是影响最终产量和回收率的重要环节。很多实验人员都会遇到一个实际问题：

AAV 收获时，细胞裂解液和培养上清是否都需要回收？

这个问题没有绝对统一的答案。更科学的做法是：在项目初期同时评估细胞裂解液和培养上清中的 AAV 分布，再根据血清型、包装体系、收获时间、下游纯化能力和实验目的决定是否双回收。

如果项目目标是尽可能提高总回收率，细胞裂解液和培养上清通常都值得纳入评估；但如果上清中 AAV 占比很低，且处理上清会明显增加纯化负担，则可以在数据支持下优先处理细胞部分。

一、AAV 为什么会同时存在于细胞内和上清中？

AAV 包装完成后，并不会全部停留在同一个位置。病毒颗粒通常可能分布在两个部分。

1. 细胞内：Cell Pellet / Cell Lysate

多数 AAV 在包装细胞内完成组装，因此相当一部分病毒颗粒会滞留在细胞内部，需要通过细胞裂解才能释放出来。

在常见的 HEK293 三质粒瞬时转染包装体系中，细胞裂解液通常是 AAV 的重要来源。

2. 培养上清：Supernatant

部分 AAV 也可能存在于培养上清中。其来源可能包括：

• 细胞自然释放；
• 细胞状态下降后发生泄漏或晚期裂解；
• 不同血清型导致的细胞内外分布差异；
• 培养时间、培养方式和培养基体系对病毒积累的影响。

因此，上清中检测到 AAV 并不一定只代表细胞裂解或死亡，也可能与特定血清型和生产体系的胞外积累特征有关。

如果只回收其中一个部分，可能会造成病毒损失，影响最终滴度和总体回收率。

二、为什么很多实验会同时评估或回收裂解液和上清？

主要原因在于：提高总回收率，减少病毒损失。

在常见的 HEK293 AAV 包装体系中，病毒在细胞内和上清中的分布往往并不完全一致。

一般来说：

• 细胞裂解液：通常含有较高比例的 AAV；
• 培养上清：也可能含有不可忽略的病毒颗粒。

如果仅收集细胞而直接丢弃上清，可能损失一部分病毒；反过来，如果只收集上清而忽略细胞裂解液，损失通常会更明显。

对于以下项目，双回收通常更值得优先评估：

• 高滴度制备；
• 动物实验用样品；
• 大规模生产；
• 低表达或难包装载体；
• 样品珍贵、对最终得率要求较高的项目。

不过需要注意的是，双回收提高的是前端总回收潜力，并不一定意味着最终纯化后合格产物得率一定更高。

培养上清体积通常较大，纳入处理后可能增加过滤、浓缩和纯化压力，也可能带来更多培养基成分、宿主细胞蛋白或宿主细胞 DNA 等杂质。因此，是否双回收还需要结合下游工艺综合判断。

三、不同 AAV 血清型，病毒分布可能不同

不同 AAV 血清型在细胞内和上清中的分布并不完全相同。

例如：

• 某些血清型更倾向于保留在细胞内；
• 某些血清型则可能有更高比例积累于培养上清。

但血清型并不是唯一决定因素。即使是同一血清型，不同项目之间的分布也可能不同。

以下因素都会影响 AAV 的细胞内外分布：

1. 载体设计

包括：

• 插入片段大小；
• 启动子类型；
• 目的基因特性；
• 基因组结构和完整性。

这些因素都可能影响包装效率、病毒产量以及细胞内外分布。

2. 转染状态

如果转染效率较低、细胞状态欠佳，AAV 的总产量和上清中的占比都可能发生变化。

3. 收获时间

AAV 通常在转染后一定时间达到较高产量。不同收获时间点下：

• 细胞内病毒比例；
• 上清中病毒累积量；
• 杂质水平；
• 病毒完整性和活性；

都可能存在差异。

收获过早，上清中的病毒可能尚未充分积累；收获过晚，则可能增加细胞碎片、宿主蛋白、宿主 DNA 等杂质负担，也可能带来病毒质量下降的风险。

4. 培养体系

贴壁培养、悬浮培养、血清培养、无血清培养等不同体系，也会影响 AAV 在细胞内和上清中的分布比例。

四、只回收裂解液或只回收上清，什么时候可以考虑？

虽然“双回收”在很多项目中值得评估，但并非所有场景都必须这样做。

1. 仅回收细胞裂解液

以下情况可以考虑优先仅回收细胞裂解液：

• 小规模研究性制备；
• 已有数据证明 AAV 主要分布于细胞内；
• 上清中 AAV 占比较低；
• 希望减少处理体积；
• 希望简化过滤、浓缩和纯化流程；
• 下游纯化平台对上样体积或杂质负荷较敏感。

这种方式操作相对简单，有利于降低工艺复杂度，但前提是要确认上清中病毒贡献有限，否则可能牺牲部分回收率。

2. 仅回收培养上清

仅回收上清的情况相对少见，但在部分工艺开发或特殊生产策略中可能采用，例如：

• 连续收获工艺；
• 希望降低细胞裂解带来的宿主细胞蛋白或宿主细胞 DNA 杂质负担；
• 目标血清型或生产体系已证明上清中 AAV 占比较高；
• 下游工艺更适合处理澄清上清。

这种策略通常需要前期数据证明：上清中 AAV 占比足够高，并且下游纯化路线能够适配。

五、收获阶段容易忽略的几个问题

即使选择同时回收细胞裂解液和上清，也需要注意以下几个关键点。

1. 避免反复冻融

反复冻融可能影响 AAV 颗粒完整性、功能活性和后续实验表现。因此，在样品处理和保存过程中，应尽量减少不必要的冻融次数。

2. 裂解要充分

如果细胞裂解不完全，细胞内 AAV 释放不足，会直接影响回收率。裂解方式需要与后续纯化流程兼容，避免引入过多杂质或影响病毒质量。

3. 上清需要澄清处理

培养上清通常需要经过离心、澄清或过滤等处理，以减少细胞碎片和颗粒性杂质进入后续纯化步骤。

4. 兼顾产量与纯度

双回收虽然可能提高总病毒回收量，但也会增加处理体积和杂质负担。最终是否采用双回收，应结合纯化能力、质量指标、成本和周期综合评估。

5. 不要只看一个“滴度”指标

建议分别检测细胞裂解液和培养上清中的 AAV 含量，并根据项目需要综合评估：

• qPCR/ddPCR 检测的病毒基因组拷贝数；
• ELISA 等方法检测的衣壳颗粒量；
• 感染性滴度或功能滴度；
• 宿主细胞蛋白、宿主细胞 DNA 等杂质水平；
• 纯化后最终得率和样品质量。

这样才能判断上清中的 AAV 是否真正“值得回收”。

六、推荐的判断思路

对于一个新的 AAV 项目，更推荐按照以下思路制定收获策略：

1. 项目初期：分别检测细胞裂解液和培养上清中的 AAV 含量；
2. 比较分布比例：判断 AAV 主要集中在细胞内，还是上清中也有可观贡献；
3. 评估下游影响：观察纳入上清后是否明显增加过滤、浓缩和纯化负担；
4. 结合项目目标：如果追求最高产量，可优先考虑双回收；如果追求流程简洁和纯化稳定，可在数据支持下聚焦细胞部分；
5. 工艺确定后：形成适合该血清型、载体和生产体系的固定收获方案。