重组 AAV（rAAV）之所以分成三个质粒一起转染，核心原因是：安全性 + 功能分离 + 生产效率。

一、三个质粒分别干什么？

1️⃣ 转移质粒（transfer / vector plasmid）

你真正想表达的东西

1.结构：ITR – 启动子 – 目的基因 – polyA – ITR

2.作用：提供被包装进 AAV 颗粒的基因组

3.关键点：

• 只有 ITR 之间的序列会被包装
• 不含任何病毒结构或复制基因 → 安全

2️⃣ Rep/Cap 质粒（包装质粒）

负责复制和“外壳”

1.Rep：

• 识别 ITR
• 复制 AAV 基因组

2.Cap：

• 编码衣壳蛋白 VP1 / VP2 / VP3
• 决定 血清型（如 AAV2/8/9）和组织嗜性

3.特点：

• 没有 ITR → 自己不会被包装

3️⃣ 辅助质粒（Helper plasmid）

模拟腺病毒“帮忙”功能

1.提供腺病毒必需功能蛋白：

• E2A
• E4
• VA RNA

2.作用：让 AAV 能在 HEK293 细胞中高效复制和装配

3.优点：不用真的感染腺病毒 → 更安全、更可控

二、为什么不做成一个质粒？

🚫 原因 1：安全性问题

如果所有元件在一个质粒上：

• 容易产生复制型 AAV（rcAAV）
• 生物安全风险大

分开后：

• Rep/Cap 没有 ITR → 不会被包装
• 转移质粒没有 Rep/Cap → 无法复制

🚫 原因 2：AAV 容量有限

AAV 最大包装能力 ≈ 4.7 kb

Rep + Cap 本身就 > 4 kb

不可能和目的基因一起装进一个基因组

🚫 原因 3：灵活性差

三质粒体系可以：

• 同一个转移质粒
• 随意换 Cap（AAV2/9/PHPeB 等）

一次构建，多种血清型通用

三、为什么是“三质粒”，不是“两质粒”或“四质粒”？

重组 AAV 分成三个质粒转染，是为了在不产生复制型病毒的前提下，高效、安全、灵活地生产只携带目的基因的 AAV 颗粒。