肾实质注射

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液（冰上解冻）、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、手术显微镜、电子天平、止血钳、弯头镊子、眼科剪、组织剪、6-0 可吸收缝线、 5-0 单丝缝线、无菌 PBS （用于稀释AAV原液）、Hamilton微量注射器(10μl)、33G针头、美洛昔康（meloxicam）（镇痛用）、棉签、手术胶带(固定动物)、无菌手术巾、金霉素眼膏（防止眼睛干燥）、碘伏、70%乙醇（消毒用）、手术台、恒温加热垫（37°C）、剃毛器、脱毛膏、棉签、生理盐水、无粉乳胶手套、手术帽、手术衣

a.AAV载体准备

在冰上轻轻融化AAV载体，避免剧烈振荡。根据实验需要用无菌PBS稀释至所需滴度，通常每只肾脏注射剂量为1×10^10-1×10^11 vg，注射体积为5-10μl。准备好的AAV溶液应置于冰上，直至使用。

b.麻醉与体位准备

用精度为 0.1 g 的电子天平将每只小鼠置于塑料烧杯中称量体重。

按体重皮下注射 5 mg/kg 美洛昔康（meloxicam），以提供术前镇痛。

将小鼠置于 4% 异氟烷（100% O₂，流量 1.5–3.0 L/min）的塑料麻醉箱中，待其完全麻醉。

将小鼠口鼻放入鼻锥，持续吸入 1.5–3.0% 异氟烷，术中全程以趾夹反射监测麻醉深度。

用棉签将眼药膏涂抹于双眼，防止角膜干燥。

使用剃毛器剃去背侧腰部区域的毛发(待暴露的肾脏侧)，用70%乙醇和碘伏交替消毒手术区域(从中心向外)，将小鼠俯卧于手术台上，将小鼠头部一侧偏斜，小鼠舌头拉至一侧嘴角，以防窒息。用手术胶带固定四肢位置。

2.病毒注射

a.在剃毛区域的腰部外侧(通常选择左侧)做一个约1-1.5cm的纵向切口，切开皮肤层。用组织剪轻轻分离皮下组织，暴露腰部肌肉。在腰肌上做一个小切口，注意避开主要血管。

b.使用钝性分离技术轻轻分离腹膜后脂肪垫，逐渐暴露肾脏。通过轻压腹壁并借助周围脂肪垫辅助外置肾脏，避免直接夹持肾实质或过度牵拉肾蒂。

使用小棉签轻轻擦拭肾脏表面，露出清晰的肾皮质区域

c.将准备好的Hamilton微量注射器与33G微量注射针连接，并排除气泡，吸取5-10μl AAV溶液(约1×10^10-1×10^11 vg)，在手术显微镜下，将针头以约30°角缓慢插入肾皮质，深度约1-2mm，缓慢地注入AAV溶液(建议在30-60秒内完成注射)，避免回流。注射完成后，保持针头在原位10-15秒，然后缓慢撤出针头。用无菌棉签轻轻按压注射点片刻，防止出血和溶液回流。

对于多点注射实验，可在肾脏不同区域重复步骤c(通常2-3个注射点，间隔至少2mm)

d.手术结束与缝合

轻轻将肾脏放回原位，注意不要扭曲肾蒂。用无菌生理盐水冲洗手术区域，清除可能的血液或溢出的AAV溶液.

用6-0可吸收缝线缝合肌肉层，用5-0 单丝缝线缝合皮肤，再次用碘伏消毒缝合区域。

3.术后护理与监测

将小鼠置于37°C恢复箱中，直至完全清醒，提供易于获取的水和食物。

术后4小时观察一次，关注呼吸、活动和出血情况。

术后 24 h 和 48 h 于小鼠背部皮下再次注射 5 mg/kg 美洛昔康镇痛。

术后 24 h 于小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水补液。

每日记录体重，连续7天。

监测手术切口愈合情况，检查有无感染迹象(红肿、分泌物)。

观察小鼠行为、活动水平和饮食情况。

适当时取出皮肤缝线(通常术后7-10天)。

4.常见问题和解决方案

肾盂注射

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液（冰上解冻）、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、电子天平、微血管夹（直型和弯型）、弯头镊子、手术剪、6-0 可吸收缝线、 5-0 单丝缝线、含 5% 山梨醇的 PBS （用于稀释AAV原液）、30G针头、PE-10 聚乙烯管、气密玻璃注射器、微量注射泵、美洛昔康（meloxicam）（镇痛用）、棉签、金霉素眼膏、碘伏、70%乙醇（消毒用）、恒温加热垫（37°C）、脱毛膏、棉签、生理盐水、无粉乳胶手套、手术帽、手术衣

a.AAV注射液的准备和装载

将 AAV 载体溶液用含 5% 山梨醇的 PBS 稀释至所需滴度（如 6.0×10¹² vg/mL），置于冰上保存。

注意：需多准备 40 µL AAV 溶液（总注射量 50 µL×小鼠只数），以补偿气密玻璃注射器及 PE-10 聚乙烯管的死腔。

用持针器将 30 G 针头尖端折弯后掰断，仅保留针头尖端。

在体视显微镜下，依次连接：30 G 针头尖端 → 15 cm PE-10 管 → 30 G 针头 → 气密玻璃注射器（如图 D）。

将连接好的气密玻璃注射器安装于微量注射泵。

用注射泵吸取90 µL AAV 载体溶液。

设置注射泵参数：目标体积 50 µL，流速 50 µL/min。

b.麻醉

用精度为 0.1 g 的电子天平将每只小鼠置于塑料烧杯中称量体重。

按体重皮下注射 5 mg/kg 美洛昔康（meloxicam），以提供术前镇痛。

将小鼠置于 4% 异氟烷（100% O₂，流量 1.5–3.0 L/min）的塑料麻醉箱中，待其完全麻醉。

将小鼠口鼻放入鼻锥，持续吸入 1.5–3.0% 异氟烷；术中全程以趾夹反射监测麻醉深度。

用棉签将眼药膏涂抹于双眼，防止角膜干燥。

c.用棉签蘸脱毛剂去除小鼠左背部毛发。注意：必须彻底冲洗脱毛膏，以防皮肤刺激。

将小鼠置于侧卧位，使待操作肾脏一侧朝上，并维持体温 37°C。

用棉签以切口为中心，交替使用碘伏和 70% 乙醇各消毒 3 次，呈环形向外扩展，覆盖无菌手术巾。

2.病毒注射

a.用镊子提起皮肤，在左肾位置（肋脊角水平）用手术剪剪开约 1 cm 皮肤切口，同长度切开肌层。

注意：切口过短无法暴露肾脏，可能误暴露较小的脾脏；过长则肾脏易滑回腹腔。

手指轻压腹部（不直接触肾），将肾脏从切口挤出（图 A）。

最少限度去除周围脂肪，使肾盂呈现为小白点。

b.先用直型微血管夹夹闭输尿管，再用弯型微血管夹一并夹闭肾动脉和肾静脉。

注意：肾脏颜色变暗红，提示血流阻断成功（图 B）。

c.用弯镊夹持 30 G 针头尖端，将其插入肾盂腔约 3 mm，启动注射泵，以 50 µL/min 速度注入 50 µL AAV 载体溶液，耗时 1 min（图 C）。

保持针头及血管夹 5 min，使肾脏充分暴露于 AAV 载体。

注意：去除血管夹后肾脏颜色立即由暗红恢复鲜红，提示血流恢复。

d.缓慢退出针头，同时用棉签轻压注射点止血。轻柔将肾脏复位至腹腔。

e.肌层以 6-0 可吸收缝线缝合，皮肤以 5-0 单丝缝线缝合。

f.于小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水补液。

更换新的 30 G 针头尖端，按机构危险废物规范丢弃旧针头，用注射泵再次吸取 50 µL AAV 载体溶液，用于下一只小鼠。

3.术后监护与护理

术后 24 h 和 48 h 于小鼠背部皮下再次注射 5 mg/kg 美洛昔康镇痛。

术后 24 h 于小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水补液。

术后 1 周内每日监测体重及一般情况。若体重下降 ≥10%，每周 3 次皮下补液 1 mL；若无改善，予以安乐死。

图1：慢速逆行肾盂（RP）注射 AAV 载体的手术步骤示意图。(A) 将小鼠置于左侧卧位暴露左肾。此方位中，图示右侧对应小鼠头部，下方对应小鼠背部。(B) 使用两把微血管夹分别夹闭尿路（1）及肾动脉和肾静脉（2）。请注意，夹闭后肾脏颜色变暗，是由于肾血流被暂时阻断所致。(C) 将 30 G 针头尖端（3）插入肾盂。(D) 注射装置按顺序连接：30 G 针头尖端（4）→ PE-10 聚乙烯管（5）→ 30 G 针头（6）→ 100 µL 气密玻璃注射器（7）→ 注射泵（8）。

图片来源：https://app.jove.com/t/67716/effective-safe-gene-delivery-to-mouse-kidney-via-slow-retrograde